Разлика между генното клониране и PCR

Ключова разлика - генното клониране срещу PCR
 

Синтезът на много копия на ДНК от конкретен фрагмент на ДНК се нарича ДНК амплификация. Има два основни процеса на амплификация на ДНК, а именно клониране на гени и PCR. Ключовата разлика между клонирането на гени и PCR е, генното клониране произвежда множество копия на конкретен ген in vivo чрез конструиране на рекомбинантна ДНК и израстване вътре в бактерията гостоприемник, докато PCR произвежда милиони копия на специфичен фрагмент на ДНК инвитро подложени на повтарящи се цикли на денатурация и синтез.

СЪДЪРЖАНИЕ
1. Преглед и ключова разлика
2. Какво е генното клониране
3. Какво е PCR
4. Паралелно сравнение - Gene Cloning срещу PCR
5. Резюме

Какво е генното клониране?

Генетичното клониране е техника, използвана за локализиране и размножаване на специфичен ген от извлечената геномна ДНК на организма чрез изграждането на рекомбинантна ДНК. Геномната ДНК съдържа хиляди различни гени, кодирани за протеини. Когато ДНК се извлече, тя включва всички възможни гени, които може да носи. Техниката за клониране на гени даде възможност за откриване на специфичен ген от общата ДНК. Следователно генното клониране служи като важен инструмент в молекулярната биология.

Създаването на геномна библиотека на организма е от съществено значение при клонирането на гените, ако няма представа за местоположението на съответния ген в ДНК. Създава се геномна библиотека, като се използват следните стъпки.

Етап 1: Екстракция на общата ДНК от организъм, който съдържа желания ген.

Стъпка 2: Рестрикционно храносмилане на извлечената ДНК за получаване на малки управляеми фрагменти. Тази стъпка се улеснява от рестрикционните ендонуклеази.

Стъпка 3: Избор на подходящ вектор и отваряне на векторната ДНК, използвайки същите рестрикционни ендонуклеази. Бактериалните плазмиди обикновено се използват като вектори за пренасяне на чужда ДНК. Плазмидите са малки кръгове от ДНК, разположени в бактериите.

Стъпка 4: Комбиниране на векторната ДНК и фрагментирана ДНК за получаване на рекомбинантна ДНК молекула. Тази стъпка се управлява от ДНК лигаза.

Стъпка 5: Прехвърляне на рекомбинантни ДНК молекули в гостоприемни бактерии. Тази стъпка е известна като трансформация и се извършва с помощта на топлинен удар.

Стъпка 5: Скрининг на трансформирани бактериални клетки върху културална среда. В края на процеса на трансформация се получава смесена популация от трансформирани и нетрансформирани гостоприемни клетки. Като интерес ген включва само в трансформирани гостоприемни клетки. Следователно е необходимо да се изберат трансформирани клетки. Изборът се извършва с помощта на селективни среди, които съдържат антибиотици. Само трансформираните клетки растат на тази скринингова среда, позволяваща селекцията.

Стъпка 6: Отглеждане на бактерии за производство на генна библиотека. В този етап трансформираните гостоприемни клетки се въвеждат в среда за свежа култура, което осигурява оптимални изисквания за растеж. Общите колонии върху културните плаки представляват геномната библиотека на този организъм.

Стъпка 7: Рекомбинантната ДНК молекула, съдържаща интересуващия ген, трябва да бъде скринирана от хиляди клонирани фрагменти от рекомбинантна ДНК. Това може да се постигне чрез използването на сонди, които бележат специфичния ген или специфичните протеини, получени от този ген.

След като заинтересованият ген, съдържащ бактериалната колония, бъде идентифициран от общите колонии, е възможно да се направят милиони копия на рекомбинантния плазмид, който съдържа гена.

Генетичното клониране се използва за създаване на генни библиотеки, за производство на специални протеини, витамини, антибиотици, хормони, секвениране и картографиране на геномите на организмите, като се правят множество копия на ДНК на индивиди в криминалистиката и т.н..

Фигура_1: Глониране

Какво е PCR?

Полимеразна верижна реакция (PCR) е техника, която генерира голям брой копия на определен ДНК фрагмент. Експоненциалното амплифициране на специфична последователност на ДНК се получава чрез PCR под инвитро условия. Тази техника е много мощен инструмент в молекулярната биология, тъй като може да умножи малка проба от ДНК в използваемо количество. PCR е въведен от Кари Мълис през 1983 г. и това наградено изобретение създава огромен напредък в молекулярната биология.

PCR техниката следва многократни PCR реакции, както е показано на Фигура 02. Една PCR реакция се състои от три основни етапа, протичащи при три различни температури; денатуриране на двуверижна при ДНК при 94 ⁰С, отгряване на праймери при 68 ⁰С и удължение на нишката при 72 ⁰В. Следователно, когато се извършва PCR, колебанията на температурата трябва да бъдат силно поддържани за правилното им възпроизвеждане. PCR се извършва в PCR машина вътре в PCR тръби. PCR епруветките се зареждат с правилни PCR смеси, съдържащи шаблонна ДНК, Taq полимераза, праймери, dNTPs и буфер. Денатурирането на двуверижна проба ДНК в едноверижна ДНК се извършва чрез разкъсване на водородните връзки между комплементарните бази при 94 - 98 ⁰В. След това единични нишки от ДНК на шаблон се излагат за праймери. Трябва да се осигурят чифт грундове (напред и назад) и те да бъдат термостабилни, за да понасят високи температури. Праймерите са едноверижни къси ДНК последователности, допълващи краищата на целевия ДНК фрагмент. В PCR се използват синтетични праймери. Праймерите се свързват с допълващите основи на пробата ДНК и инициират синтеза на нова верига. Този етап се катализира от ензим, наречен Taq полимераза; термостабилен ензим на ДНК полимераза, изолиран от Thermus auqaticus. Когато са налични праймери и нуклеотиди (градивни елементи), Taq полимераза конструира новата верига от ДНК, допълваща ДНК-образец. В края на PCR програмата се наблюдава амплифициран фрагмент на ДНК с помощта на гел електрофореза. Ако е необходим допълнителен анализ, PCR продуктът се пречиства от гела.

PCR е много полезен за диагностициране и мониторинг на генетични и придобити заболявания, идентифициране на престъпници (в областта на криминалистиката), изучаване на структурата и функцията на целеви сегмент от ДНК, секвениране и картографиране на геномите на организмите и др. рутинна лабораторна техника в изследователските лаборатории за медицинска и молекулярна биология, тъй като има голямо разнообразие от приложения.

Фигура_2: Полимеразна верижна реакция

Каква е разликата между генното клониране и PCR?

Геновото клониране срещу PCR
Генирането на гени е процесът на създаване на множество копия на конкретен ген in vivo чрез рекомбинантна ДНК и трансформиране в приемна бактерия.	PCR техниката произвежда множество копия на определена последователност на ДНК инвитро чрез многократни цикли на PCR реакции.
Изискване за конструиране на рекомбинантна ДНК
Рекомбинантна ДНК се получава с цел локализиране на гена.	Рекомбинантна ДНК не се произвежда.
Нужда от труд
Този процес е трудоемък.	Не е необходим интензивен труд.
In vivo или In vitro процес
Изграждането на рекомбинантна ДНК е инвитро и амплификацията на ДНК е in vivo.	Амплификацията на ДНК се случва напълно инвитро.

Обобщение - Генното клониране срещу PCR

Глонирането и PCR са два метода, използвани за амплификация на ДНК. PCR е ан инвитро процес, който прави множество копия на ДНК на определен ДНК фрагмент, без да се използва рекомбинантна ДНК и гостоприемник. Клонирането на гени е предимно ан in vivo процес, който води до множество копия на заинтересован ген в организма гостоприемник чрез изграждане на рекомбинантна ДНК. Това е разликата между клонирането на ген и PCR.

справка:
1. Грифитс, Антъни JF. „Клониране на специфичен ген.“ Съвременен генетичен анализ. Национална медицинска библиотека на САЩ, 01 януари 1999 г. Уеб. 22 февруари 2017г
2. "Полимеразна верижна реакция (PCR)." Национален център за информация за биотехнологиите. Националната медицинска библиотека на САЩ, n.d. Web. 22 февруари 2017г

С любезност на изображенията:
1. „Фигура 17 01 06” от CNX OpenStax - (CC BY 4.0) през Wikimedia на Commons
2. “PCR” от Madprime - Собствена работа (CC BY-SA 3.0) през Wikimedia на Commons