Разлика между NGS и Sanger Sequisting

Ключова разлика - NGS срещу Sanger Sequisting
 

Секвениране от следващо поколение (NGS) и Сангер секвениране са два вида техники за нуклеотидно секвениране, разработени във времето. Методът на Sanger Sequisting се използва широко в продължение на много години и NGS го замени наскоро поради своите предимства. Ключовата разлика между NGS и Sanger Sequisting е в това NGS работи на принципа на секвениране на милиони секвенции едновременно по бърз начин чрез секвенираща система, докато Sanger Sequisting работи върху главната верига на прекъсване поради селективно включване на дидеоксинуклеотиди от ензима на ДНК полимераза по време на репликацията на ДНК и полученото отделяне на фрагменти от капиляра електрофореза.

СЪДЪРЖАНИЕ
1. Преглед и ключова разлика
2. Какво е нуклеотидно секвениране
3. Какво е NGS
4. Какво е Sanger Sequisting
5. Паралелно сравнение - NGS срещу Sanger Sequisting
6. Резюме

Какво е нуклеотидно секвениране?

Генетичната информация се съхранява в нуклеотидните последователности на ДНК или РНК на организъм. Процесът на определяне на правилния ред на нуклеотидите (с използване на четири бази) в даден фрагмент (в ген, клъстер от гени, хромозома и пълен геном) е известен като нуклеотидно секвениране. Много е важно в геномните изследвания, криминалистичните изследвания, вирусологията, биологичната систематика, медицинската диагностика, биотехнологиите и в много други области да се анализира структурата и функцията на гените. Има различни видове методи за секвениране, разработени от учени. Между тях, Сигурно секвениране разработен от Фредерик Сангер през 1977 г. е широко използван и популяризиран за дълъг период от време Секвениране от следващо поколение замести го.

Какво е NGS?

Секвениране на следващо поколение (NGS) е термин, използван за обозначаване на съвременни процеси на секвениране с висока пропускателна способност. Той описва редица различни съвременни технологии за секвениране, които направиха революция в геномните изследвания и молекулярната биология. Тези техники са Illumina секвениране, Roche 454 секвениране, Ion Proton секвенсиране и SOLiD (Sequisting by Oligo Ligation Detection) секвениране. NGS системите са по-бързи и по-евтини. Четири основни метода за секвениране на ДНК се използват в NGS системи, а именно; пироцениране, секвениране чрез синтез, секвениране чрез лигиране и йонно полупроводниково секвениране. Голям брой нишки на ДНК или РНК (милиони) могат да бъдат секвенирани паралелно. Той позволява секвениране на целия геном на организмите за кратък период от време, за разлика от Сангер секвенирането, което отнема повече време.

NGS има много предимства пред конвенционалния метод на секюринг Сангер. Това е високоскоростен, по-точен и рентабилен процес, който може да се извърши с малък размер на извадката. NGS може да се използва при метагеномични изследвания, при откриване на вариации в рамките на отделен геном, дължащи се на вмъкване и делеция и т.н., и при анализ на генни експресии.

Фигура_1: Развития в секвестирането на NGS

Какво е Sanger Sequisting?

Sanger Sequisting е метод за секвениране, разработен от Фредерик Сангер и неговите колеги през 1977 г. за определяне на точния нуклеотиден ред на даден фрагмент от ДНК. Той също е известен като секвенциране на верижното прекратяване или Дидеокси последователност. Принципът на работа на този метод е прекратяване на синтеза на веригата чрез селективно включване на верига, завършваща дидеоксинуклеотиди (ddNTP) като ddGTP, ddCTP, ddATP и ddTTP чрез ДНК полимераза по време на репликацията на ДНК. Нормалните нуклеотиди имат 3 'ОН групи за образуване на фосфодиестерна връзка между съседни нуклеотиди, за да продължи образуването на нишката. Въпреки това, на DDNTP липсва тази 3 'ОН група и не са в състояние да образуват фосфодиестерни връзки между нуклеотиди. Следователно удължението на веригата е прекратено.

При този метод едноверижната ДНК, която трябва да бъде секвенирана, служи като шаблон за направление инвитро Синтез на ДНК. Други изисквания са олигонуклеотидният праймер, дезоксинуклеотидните прекурсори и ензимът на ДНК полимераза. Когато страничните краища на целевия фрагмент са известни, праймерите могат лесно да бъдат проектирани за репликация на ДНК. Четири отделни реакции на синтез на ДНК се провеждат в четири отделни епруветки. Всяка тръба има отделни ddNTP, заедно с други изисквания. От конкретния нуклеотид се добавя смес от dNTPs и ddNTP. По същия начин, четири отделни реакции се провеждат в четири епруветки с четири смеси. След реакциите се провежда откриването на ДНК фрагменти и превръщането на фрагментния модел в информация за последователността. Получените ДНК фрагменти се денатурират топлинно и се разделят с гел електрофореза. Ако се използват радиоактивни нуклеотиди, схемата на свързване в полиакриламидния гел може да бъде визуализирана чрез авторадиография. Когато този метод използва флуоресцентно маркирани дидеоксинуклеотиди, той може да бъде смекчен надолу по отчетения гел и да премине през лъч на лазер, за да бъде открит от флуоресцентния детектор. За да се избегнат грешки, които могат да възникнат, когато една последователност се чете от окото и се въвежда ръчно в компютър, този метод се развива в използването на автоматизиран секвенсор, съчетан с компютъра.

Това е методът, използван за секвениране на ДНК от проекта за човешкия геном. Този метод все още се използва с усъвършенствани модификации, тъй като дава точна информация за последователността, въпреки че е скъп и бавен процес.

Фигура_2: Сигурно секвениране

Каква е разликата между NGS и Sanger Sequisting?

NGS срещу Sanger Sequisting
Секвениране от следващо поколение (NGS) се отнася до съвременните процеси за секвениране с висока пропускателна способност. Той описва редица различни съвременни технологии за секвениране	Сангер секвениране е метод за секвениране, разработен от Фредерик Сангер, за да се определи точния нуклеотиден ред на даден фрагмент от ДНК.
Ефективност на разходите
NGS е по-евтин процес, защото намалява времето, енергията на човека и химикалите.	Това е скъп процес, защото отнема време, сила на човека и повече химикали.
скорост
Това е по-бързо, тъй като както химическото откриване, така и сигналното откриване на много направления се случват паралелно.	Това отнема много време, тъй като химическото откриване и разпознаване на сигнали се случват като два отделни процеса и само в нишката може да се чете наведнъж.
надеждност
NGS е надежден.	Сигурното секвениране е по-малко надеждно
Размер на пробата
NGS изисква по-малко количество ДНК.	Този метод се нуждае от голямо количество шаблонна ДНК.
ДНК бази на последователен фрагмент
Броят на ДНК базите на секвенциран фрагмент е по-нисък от метода на Сангер	Генерирането на последователности е по-дълго от NGS последователностите.

Обобщение - NGS срещу Sanger Sequisting

NGS и Сангер секвенирането са техники за нуклеотидно секвениране, широко използвани в молекулярната биология. Сингерното секвениране е метод за ранно секвениране, който е заменен от NGS. Основната разлика между NGS и Sanger Sequisting е, че NGS е високоскоростен, по-точен и рентабилен процес от Sanger секвениране. И двете техники създадоха големи огнища в генетиката и биотехнологиите.

справка:
1. Норусиан, Мину. „Техники за секвениране на следващо поколение за еукариотни микроорганизми: решения, базирани на секвениране на биологични проблеми“. Еукариотна клетка. Американско общество за микробиология, септември 2010 г. 18 февруари 2017г
2. Сангер, Ф., С. Никлен и А. Р. Кулсън. „ДНК секвениране с верижни крайни инхибитори.“ Трудове на Националната академия на науките 74.12 (1977): 5463-467. мрежа.
3. Лю, Лин, Йинху Ли, Силянг Ли, Ни Ху, Имин Хе, Рей Понг, Дани Лин, Лихуа Лу и Маги Лоу. „Сравнение на системите за последващо поколение от следващо поколение.“ Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012 (2012): 1-11. мрежа.

С любезност на изображенията:
„Сангер-последователност“ от Естевеж - Собствена работа (CC BY-SA 3.0) през Wikimedia на Commons 
„Развития в следващото поколение последователност“ От Nederbragt, Lex (2012) - (CC BY 3.0) през Commons Wikimedia