Разлика между сигурно секвениране и пиросеквенция

Ключова разлика - Сигурно секвениране срещу пиросеквенция
 

ДНК секвенирането е много важно за ДНК анализа, тъй като познаването на правилната нуклеотидна подредба в определен ДНК регион разкрива много важна информация за него. Има различни методи за секвениране на ДНК. Сингерното секвениране и пиросеквенцията са два различни метода на секвениране на ДНК, широко използвани в молекулярната биология. Ключовата разлика между последователността на Sanger и Pyrosequences е тази Сангер секвенирането използва дидеоксинуклеотиди, за да прекрати синтеза на ДНК, за да прочете нуклеотидната последователност, докато пиросеквенцията открива освобождаването на пирофосфат чрез включване на нуклеотидите и синтезиране на допълващата последователност, за да се прочете точният ред на последователността.

СЪДЪРЖАНИЕ
1. Преглед и ключова разлика
2. Какво е Sanger Sequisting
3. Какво е Pyrosequences
4. Паралелно сравнение - по-сигурно секвениране срещу пиросеквенция
5. Резюме

Какво е Sanger Sequisting?

Сангер секвенирането е метод за секвениране на ДНК от първо поколение, разработен от Фредерик Сангер и неговите колежи през 1977 г. Той е известен също като Последователно прекъсване на веригата или Дидеокси последователност тъй като се основава на прекратяване на веригата от дидеоксинуклеотиди (ddNTP). Този метод се използва широко повече от 30 години, докато се разработи секвенцията от ново поколение (NGS). Сангер секвенционната техника даде възможност за откриване на правилния нуклеотиден ред или закрепването на определен ДНК фрагмент. Той се основава на селективното включване на ddNTP и прекратяване на синтеза на ДНК по време на инвитро ДНК репликация. Отсъствието на 3 'ОН групи за продължаване на образуването на фосфодиестерна връзка между съседни нуклеотиди е уникална характеристика на ddNTP. Следователно, след като DDNTP е прикрепен, удължаването на веригата спира и прекратява от тази точка. Съществуват четири ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP и ddTTP - използвани в последователността на Сангер. Тези нуклеотиди спират процеса на репликация на ДНК, когато са включени в нарастващата нишка на ДНК и водят до различна дължина на късата ДНК. Капилярната гел електрофореза се използва за организиране на тези къси нишки на ДНК по техните размери върху гел, както е показано на фигура 01.

Фигура 1: Електрофореза на капилярна гел на синтезирана къса ДНК

За инвитро репликация на ДНК, трябва да се предвидят няколко изисквания. Те са ензим на ДНК полимераза, шаблонна ДНК, олигонуклеотидни праймери и дезоксинуклеотиди (dNTPs). При секюринг на Сангер репликацията на ДНК се извършва в четири отделни епруветки заедно с четири типа ddNTP. Деоксинуклеотидите не се заместват напълно от съответните ddNTP. Смес от конкретния dNTP (например; dATP + ddATP) се включва в тръбата и се репликира. Четири отделни тръбни продукта се пускат върху гел в четири отделни ямки. След това, като прочетете гела, последователността може да бъде конструирана, както е показано на фигура 02.

Фигура 02: Сигурно секвениране

Сингерното секвениране е важна техника, която помага в много области на молекулярната биология. Проектът с човешкия геном беше успешно завършен с помощта на методите, базирани на Сангер. Сингерното секвениране е полезно също при целево ДНК секвениране, изследвания за рак и генетични заболявания, анализ на генната експресия, идентификация на човека, откриване на патогени, секвенция на микроби и т.н..

Има няколко недостатъка на последователността на Сангер:

• Дължината на секвенираната ДНК не може да бъде по-голяма от 1000 базови двойки
• Само едно направление може да бъде секвенирано наведнъж.
• Процесът отнема много време и е скъп.

Поради това с времето бяха разработени нови усъвършенствани техники за секвениране за преодоляване на тези проблеми. Въпреки това, последователността на Сангер все още се използва поради своите много точни резултати до приблизително 850 фрагмента с дължина на основната двойка.

Какво е пиросекцията?

Пиросеквенирането е нова техника на секвениране на ДНК, базирана на „секвениране чрез синтез“. Тази техника разчита на откриването на освобождаване на пирофосфат при включването на нуклеотида. Процесът се използва от четири различни ензима: ДНК полимер, ATP сулфурилаза, луцифераза и апираза и два субстрата аденозин 5 'фосфосулфат (APS) и луциферин.

Процесът започва с свързването на праймера с едноверижния ДНК шаблон и ДНК полимеразата започва включването на нуклеотиди, допълващи се към него. Когато нуклеотидите се съединят (полимеризация на нуклеинова киселина), той отделя пирофосфатни (две фосфатни групи, свързани заедно) групи и енергия. Всяко добавяне на нуклеотиди освобождава еквимоларно количество пирофосфат. Пирофосфатът се превръща в ATP чрез ATP сулфурилаза в присъствието на субстрат APS. Генерираният АТФ задейства превръщането на луциферин в оксилуциферин, медиирано от луцифераза, като произвежда видима светлина в количества, пропорционални на количеството на АТФ. Светлината се открива от устройство за откриване на фотони или от фотоумножител и създава пирограма. Апираза разгражда ATP и неинкорпорирани dNTPs в реакционната смес. добавянето на dNTP се извършва веднъж по едно. Тъй като прибавянето на нуклеотид е известно според включването и откриването на светлина, последователността на шаблона може да бъде определена. Пирограма се използва за генериране на нуклеотидната последователност на пробата ДНК, както е показано на Фигура 03.

Пиросеквенирането е много важно при анализа на единичния нуклеотиден полиморфизъм и секвенцирането на къси участъци от ДНК. Високата точност, гъвкавостта, лекотата на автоматизация и паралелната обработка са предимствата на пиросеквенцията над техники за секвениране на Sanger.

Фигура 03: Пиро последствия

Каква е разликата между Sanger Sequisting и Pyrosequences?

Сигурно секвениране срещу пиросеквенция
Сангер секвенирането е метод на секвениране на ДНК, основан на селективното включване на ddNTPs чрез ДНК полимераза и прекратяване на веригата.	Пиросеквенирането е метод на секвениране на ДНК, основан на откриването на освобождаване на пирофосфат при включването на нуклеотид.
Използване на ddNTP
ddNTP се използват за прекратяване на репликацията на ДНК	ddNTP не се използват.
Ензими, участващи
Използва се ДНК полимераза.	Използват се четири ензима: ДНК полимераза, АТФ сулфурилаза, Луцифераза и Апираза.
Използвани субстрати
APS и Luciferin не се използват.	Използват се аденозин 5 'фосфосулфат (APS) и луциферин.
Максимална температура
Това е бавен процес.	Това е бърз процес.

Обобщение - Сигурно секвениране срещу пиросеквенция

Сингерното секвениране и пиросеквенцията са два метода на секвениране на ДНК, използвани в молекулярната биология. Сингерното секвениране конструира реда на нуклеотидите последователно чрез прекратяване на удължаването на веригата, докато пиросеквенцирането изгражда точния ред на нуклеотидите последователно чрез включване на нуклеотиди и откриване на освобождаване на пирофосфати. Следователно, основната разлика между секюринга на Сангер и пиросеквенцията е, че Сангер секвенирането работи върху секвениране чрез прекъсване на веригата, докато пиросеквенционирането работи върху секвенирането чрез синтез.

справка:
1. Fakruddin, Md и Abhijit Chowdhury. „Пиросеквенция - алтернатива на традиционното опасно секвениране.“ Американско списание за биохимия и биотехнологии. Научни публикации, 02 март 2012. Web. 28 февруари 2017г.
2. "Сигурно секвениране." Сигурно секвениране - теми от ScienceDirect. N.p., n.d. Web. 28 февруари 2017г

С любезност на изображенията:
1. „Дидезокси-метод“ от Кристоф Гоманс (модифициран) - д-р Норман Модър, auf Basis einer Datei von Кристоф Гоман (CC BY-SA 3.0) през Commons Wikimedia
2. „Sanger-DNA-seq“ от Enzo от полския език Wikipedia (CC BY-SA 3.0) през Commons Wikimedia
3. „Пиросеквенция“ от микробиологични батерии (CC BY-SA 2.0) чрез Flickr