Разлика между PCR и ДНК секвениране

Ключова разлика - PCR срещу ДНК секвениране
 

PCR и ДНК секвенцирането са две важни техники в молекулярната биология. Полимеразна верижна реакция (PCR) е процесът, който създава голям брой копия на ДНК фрагмент. ДНК последователността е техниката, която води до точния ред на нуклеотидите на даден ДНК фрагмент. Това е ключовата разлика между секвенцията на PCR и ДНК. PCR е една от основните стъпки, участващи в секвенирането на ДНК.

СЪДЪРЖАНИЕ
1. Преглед и ключова разлика
2. Какво е PCR
3. Какво е секвениране на ДНК
4. Паралелно сравнение - PCR срещу ДНК секвениране
5. Резюме

Какво е PCR?

Полимеразна верижна реакция (PCR) е техника за амплификация на ДНК, използвана в молекулярната биология. Той произвежда хиляди до милиони копия на определен фрагмент от ДНК. Този метод е разработен от Кари Мълис през 1983 г. При тази техника фрагментът от ДНК, който трябва да бъде амплифициран, служи като шаблон и ензимът на ДНК полимераза добавя допълнителни нуклеотиди към праймера, който се предлага в PCR сместа. В края на PCR реакцията се синтезират много копия на пробата ДНК.

Има различни компоненти на PCR сместа, включително ДНК, ДНК полимераза (Taq полимераза), праймери (предни и обратни праймери), нуклеотиди (градивни части на ДНК) и буфер. PCR се случва вътре в PCR машина и правилната PCR смес трябва да бъде заредена в машината и правилната програма трябва да бъде задвижвана. Тази техника позволява производството на хиляди до милиони копия на определен участък от ДНК от много малко количество ДНК.

PCR реакциите протичат циклично, за да се получи видимото количество PCR продукти в гел. Има три основни етапа, участващи в PCR реакция, а именно денатурация, отгряване на праймерите и удължаване на нишката, както е показано на фигура 01. Тези три стъпки се извършват при три различни температури. ДНК съществуват в двуверижна форма чрез водородни връзки между комплементарните бази. Преди импликацията, двуверижната ДНК трябва да бъде отделена една от друга. Извършва се чрез даване на висока температура. При висока температура, двуверижна ДНК денатурация в единични нишки. Тогава праймерите трябва да се доближат до страничните краища на специфичния фрагмент или гена на ДНК. Праймерът е късо парче от едноверижна ДНК, което е допълващо целевата последователност. Предни и обратни праймери се отгряват с допълващи се основи в страничните краища на денатурираната проба ДНК при температура на отгряване. Грундовете трябва да са устойчиви на топлина. След като праймерите се отпарят с ДНК на пробата, ензимът taq полимераза инициира синтеза на новите нишки чрез добавяне на нуклеотиди, които са комплементарни към целевата ДНК. Taq полимераза е ензим, устойчив на топлина, изолиран от термофилна бактерия, наречена Thermus aquaticus. PCR буферът поддържа оптималните условия за действие taq полимераза. Тези три етапа на PCR реакции се повтарят, за да се получи необходимото количество PCR продукт. След всяка PCR реакция броят на копието на ДНК се удвоява. Следователно, може да се наблюдава експоненциално усилване при PCR. PCR продуктите могат да се наблюдават с помощта на гел електрофореза и могат да бъдат пречистени за допълнителни изследвания.

Фигура 01: Основни стъпки на PCR реакция

PCR е ценен инструмент в медицинските и биологични изследвания. PCR има специална стойност в криминалистиката, тъй като може да амплифицира ДНК за изследвания от мъничките проби от престъпниците и да направи криминалистични ДНК профили. PCR е широко използван в много области на молекулярната биология, включително, генотипиране, клониране на гени, откриване на мутации, секвениране на ДНК, ДНК микрочипове и тестване на бащинство и т.н..

Фигура 02: Полимеразна верижна реакция

Какво е ДНК секвениране?

ДНК последователността е определянето на точен ред на нуклеотидите - аденин, гуанин, цитозин и тимин в даден фрагмент от ДНК. Генетичната информация се съхранява в ДНК последователностите, като се използва правилния ред на нуклеотидите. Следователно намирането на точния ред на нуклеотидите в фрагмент на ДНК е много важно да се знае за структурата и функцията на гените.

Протоколът за секвениране на ДНК включва различни процеси. Първата стъпка е изолирането на заинтересованата ДНК или геномната ДНК на организма. Използвайки PCR (както е описано по-горе), желаният участък от ДНК трябва да бъде амплифициран. Амплифицираният PCR продукт трябва да бъде отделен с гел електрофореза и пречистен. Амплифицираните фрагменти се обслужват като шаблони за секвениране. Секвенирането може да се извърши или следвайки последователност на Сангер или метод за секвениране с висока пропускателна способност. Сингерното секвениране изисква капилярна електрофореза на получените фрагменти от ДНК. Определянето на правилния нуклеотиден ред може да се извърши чрез ръчно отчитане на авторадиографи или с помощта на автоматизирани ДНК секвентори.

Последователността на гените допринесе за проекта за човешкия геном и улесни картографирането на човешкия геном през 2003 г. В криминалистиката ДНК секвенсирането даде възможност за идентифициране на индивиди, които показват уникални ДНК последователности и идентифицират престъпниците. В медицината секвенирането на ДНК може да се използва за откриване на гените, отговорни за генетични и други заболявания, за намиране на дефектни гени и замяна на тях с правилни гени. В селското стопанство информацията за секвениране на ДНК на някои микроорганизми се използва за производство на трансгенни култури с икономически желани характеристики.

Фигура 03: ДНК секвениране

Каква е разликата между PCR и ДНК секвениране?

PCR срещу ДНК секвениране
PCR процес създава хиляди до милиони копия на заинтересования ДНК фрагмент.	ДНК секвенирането е процесът на определяне на точния ред на нуклеотидите в даден ДНК фрагмент.
изход
PCR създава хиляди до милиони копия на определен ДНК фрагмент	Това води до правилния ред на базите в определен ДНК фрагмент.
Участие на DDNTP
PCR не изисква ddNTP. Той използва dNTP.	ДНК секвенирането изисква ddNTPs за прекратяване на образуването на нишки.

Обобщение - PCR срещу ДНК секвениране

PCR и ДНК секвенирането са много важни инструменти в много области на молекулярната биология. Амплификацията на ДНК фрагментите се извършва с PCR техниката, докато правилният ред на нуклеотидите на ДНК фрагмент се определя от секвенцията на ДНК. Това е разликата между PCR и ДНК секвениране.

справка:
1. "Полимеразна верижна реакция (PCR)." Национален център за информация за биотехнологиите. Националната медицинска библиотека на САЩ, n.d. Web. 21 февруари 2017г.
2. Шендур, Джей и Ханли Джи. „ДНК последователности от следващо поколение.“ Nature News. Nature Publishing Group, 09 октомври 2008. Web. 21 февруари 2017г

С любезност на изображенията:
1. „PCR стъпки“ от Tinojasontran - Собствена работа (Public Domain) през Commons Wikimedia
2. "Полимеразна верижна реакция" от Enzoklop - Собствена работа (CC BY-SA 3.0) през Commons Wikimedia
3. „ДНК последователност“ от Sjef - Собствена работа (Public Domain) през Commons Wikimedia