Разлика между RT PCR и QPCR

Ключова разлика - RT PCR срещу QPCR
 

Полимеразна верижна реакция е техника, използвана за амплифициране на специфичен участък от ДНК инвитро. Благодарение на изобретението на тази техника от Кари Мълис през 1983 г., учените успяват да направят хиляди до милиони копия на специфични фрагменти от ДНК за изследователски цели. В момента тя се е превърнала в обичайна и рутинно изпълнена техника в клинични и изследователски лаборатории за голямо разнообразие от приложения. Има вариации на традиционната PCR техника като RT PCR, вложен PCR, мултиплексен PCR, Q PCR, RT - QPCR и др. RT PCR и Q PCR са две важни вариации на PCR. Ключовата разлика между RT PCR и Q PCR е тази RT PCR се използва за откриване на генна експресия чрез създаване надопълваща ДНК (cDNA) стенограми от РНК докато Q PCR се използва за количествено измерване на PCR продуктите в реално време с помощта на флуоресцентни багрила.

СЪДЪРЖАНИЕ
1. Преглед и ключова разлика
2. Какво е RT PCR
3. Какво е QPCR
4. Паралелно сравнение - RT PCR срещу QPCR
5. Резюме

Какво е RT PCR?

Полимеразната верижна реакция с обратна транскрипция (RT PCR) е вариант на PCR, който се използва за откриване на експресия на РНК. Това е много важен метод за откриване на мРНК експресия в тъканите. RT PCR се използва, когато изходният материал на пробата е РНК. В RT PCR шаблонната иРНК първо се превръща в допълваща ДНК. Този етап се катализира от ензимната обратна транскриптаза и процесът е известен като обратна транскрипция. Второ, традиционната PCR се използва за новосинтезираната кДНК за амплификацията.

RT PCR е силно чувствителна техника, която изисква сравнително малко количество РНК проба. RT PCR обикновено се използва при диагностициране и количествено определяне на РНК видове, особено на РНК вируси като вирус на човешка имунодефицит и вирус на хепатит С.

Фигура 01: RT PCR техника

Какво е QPCR?

Количественият PCR (QPCR) е вариант на PCR, който се използва за количествено измерване на PCR продуктите. Също така се нарича верижна реакция на полимераза в реално време, тъй като измерва усилването в реално време с помощта на PCR машина в реално време. Това е подходящ метод за определяне на количеството на целева последователност или ген, присъстващо в пробата. Интересната особеност на QPCR е, че той комбинира както усилване, така и истинско количествено определяне в една стъпка. Следователно необходимостта от гел електрофореза при откриване може да бъде премахната чрез QPCR техника. QPCR използва флуоресцентни багрила, за да маркира PCR продуктите по време на PCR реакциите, които в крайна сметка водят до директно количествено определяне. Когато PCR продуктите се натрупат, флуоресцентните сигнали също се натрупват и той ще бъде измерван от машината в реално време. QPCR може да се комбинира с RT PCR. Известен е като RT - QPCR или QRT - PCR и се счита за най-мощен, чувствителен и количествен метод за откриване на нивата на РНК в клетките или тъканите.

SYBR Green и Taqman са два метода, използвани за откриване или наблюдение на процеса на амплификация на PCR в реално време. SYBR Green методът се осъществява с помощта на флуоресцентно багрило, наречено SYBR green и открива амплификацията чрез свързване на багрилото за получаване на двойно верига ДНК. Taqman се осъществява с помощта на сонди с двоен белег и открива амплификацията чрез разграждане на сондата от Taq полимераза и освобождаване на флуорофор, както е показано на фигура 02. И двата метода наблюдават хода на процеса на амплификация и отчитат количеството на продукта в реално време.

PCR в реално време има голямо разнообразие от приложения като количествено определяне на генната експресия, анализ на микроРНК и некодиране на РНК, SNP генотипиране, откриване на варианти на броя на копията, откриване на редки мутации, откриване на генетично модифицирани организми, откриване на инфекциозни агенти и др..

Фигура 02: Количествена PCR техника

Каква е разликата между RT PCR и QPCR?

RT PCR срещу QPCR
RT PCR е техника, използвана за откриване на генна експресия чрез амплификация.	QPCR е техника, която амплифицира ДНК и определя количествено PCR продуктите в реално време.
Участие на ензима на обратната транскриптаза
Ензимната обратна транскриптаза се използва за RT PCR.	Ензимната обратна транскриптаза не се използва за QPCR.
Използване на флуоресцентни молекули
Флуоресцентно оцветени багрила или сонди не се използват за RT PCR.	Флуоресцентно оцветени багрила или сонди се използват за QPCR.
Количествено определяне на PCR продукта
Освен в комбинация с QPCR, RT PCR не определя количествено PCR продукта.	QPCR измерва количествено PCR продукта.
Изходен материал
Изходният материал е мРНК.	Изходен материал е ДНК.
Синтез на кДНК
Допълнителна ДНК се получава по време на RT PCR.	Допълнителна ДНК не се произвежда по време на QPCR.

Обобщение - RT PCR срещу QPCR

RT PCR и QPCR са две версии на традиционния PCR. RT PCR техниката се провежда за мРНК проби и се задвижва чрез обратна транскрипция и продукция на кДНК. QPCR се използва за количествено определяне на PCR продуктите по време на термичните цикли на PCR в реално време, използвайки флуоресцентни багрила или маркирани сонди. В QPCR количеството на PCR продукта е представено от излъчените флуоресцентни сигнали от пробата. RT PCR популярно се използва като процес на амплификация, докато QPCR обикновено се използва като метод за количествено определяне. Това е разликата между RT PCR и QPCR.

Препратки:
1. Deepak, SA, KR Kottapalli, R. Rakwal, G. Oros, KS Rangappa, H. Iwahashi, Y. Masuo и GK Agrawal. „PCR в реално време: революционен анализ на откриване и експресионен анализ на гените.“ Текуща геномика. Bentham Science Publishers Ltd., юни 2007 г. Web. 03 април 2017г
2. Зека, Фьоралба, Катриен Вандерхайден, Елс Де Смет, Клод А. Кувелие, Питер Мещад и Джо Вандесомпеле. „Анализ на генната експресия на FFPE проби, базиран на прям и чувствителен RT-qPCR.“ Nature News. Nature Publishing Group, 22 февруари 2016. Web. 03 април 2017г
3. Overbergh, L., A. Giulietti, D. Valckx, B. Decallonne, R. Bouillon и C. Mathieu. „Използването на PCR в реално време на обратната транскриптаза за количествено определяне на експресията на цитокин гена.“ Списание за биомолекулярни техники: JBT. Асоциацията на съоръженията за биомолекулярни ресурси, март 2003 г. 03 април 2017г

С любезност на изображенията:
1. „Taqman“ от потребител: Braindamaged - Собствена работа от оригиналния качител (Public Domain) чрез Commons Wikimedia
2. „Полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция“ От Jpark623 - Собствена работа (CC BY-SA 3.0) през Commons Wikimedia